En busca de posibles dianas terapA�uticas antibacterianas

Las dobles roturas de cadena en el DNA (DSBs; del inglA�s a�?double strand breaksa�?) son consideradas como el tipo de daA�o mA?s letal en nuestro genoma, ya que un fallo en su reparaciA?n puede suponer la muerte celular o la transformaciA?n tumoral.

La reuniA?n de extremos no-homA?logos, conocida por las iniciales NHEJ (del inglA�s a�?non-homologous end joininga�?), es un mecanismo de reparaciA?n de DSBs que puede operar en cualquier fase del ciclo celular, y que en mamA�feros es esencial para mantener la estabilidad del genoma. Este mecanismo recurre a una combinaciA?n de proteA�nas encargadas de la protecciA?n y del mantenimiento de la proximidad de los extremos (heterodA�mero Ku70-Ku80, DNAPKcs), y del procesamiento necesario (nucleasas, DNA polimerasas y ligasas) para reparar la rotura. En cierto sentido, el sistema de NHEJ opera como el a�?kit de un pegamento de contactoa�? que limpia, rellena y empalma la rotura producida, aunque en este proceso sea inevitable que se produzca algA?n cambio o pA�rdida de nucleA?tidos. Este mecanismo puede ser ademA?s un arma de doble filo ya que, si se producen varias roturas simultA?neas, es potencialmente posible la fusiA?n del extremo de una rotura con otro extremo de una rotura diferente, que puede estar alejada en el genoma o incluso formar parte de un cromosoma diferente, generA?ndose una translocaciA?n que puede activar un oncogen.

En contraste, los organismos eucariA?ticos unicelulares como las levaduras, aA?n poseyendo los componentes del sistema de NHEJ, reparan la mayorA�a de sus DSBs mediante un proceso de recombinaciA?n que involucra un gran nA?mero de componentes proteicos, y que utiliza una cadena de DNA reciA�n replicada como a�?copia maestra de seguridada�?. De esta manera, la reparaciA?n ocurre sin errores.

Hace 5 aA�os, el grupo del Dr. Aidan Doherty (Univ. Sussex. UK) demostrA? que el sistema de NHEJ no era exclusivo delA� mundo eucariA?tico, ya que muchas bacterias poseA�an un sistema de NHEJ a�?minimalistaa�?, basado A?nicamente en dos componentes: una A?nica proteA�na Ku bacteriana, y una ligasa especA�fica denominada LigD. LigD es, sin embargo, una proteA�na multifuncional que posee tres dominios estructuralmente independientes, que aportan las tres actividades necesarias para el procesamiento y empalme de los extremos de la rotura: nucleasa, polimerasa y ligasa. Desde el punto de vista evolutivo, el mA?dulo de polimerizaciA?n (PolDom) de LigD deriva del ancestro de las primasas eucariA?ticas, cuya funciA?n en este caso es la de sintetizar las pequeA�as molA�culas de RNA que sirven de iniciadores o a�?primersa�? durante la replicaciA?n del DNA.

En un trabajo conjunto publicado hace unos aA�os en la revista Journal of Molecular Biology, los grupos del Dr. Doherty y del Dr. Luis Blanco (CBMSO, CSIC) mostraron la estructura 3D del dominio PolDom de la LigD de Mycobacterium tuberculosis, y cA?mo esta proteA�na (en ausencia de Ku)A� era capaz de interaccionar con extremos de DNA, y de llevar a cabo reacciones de sA�ntesis muy similares a las de sus ortA?logos eucariA?ticos, PolI� y PolA�, identificadas en el laboratorio del Dr. Blanco, y que participan en el mecanismo de NHEJ en cA�lulas humanas.

Posteriormente, en un trabajo publicado en el aA�o 2007 en la revista Science, identificamos las bases estructurales que permiten a dos monA?meros PolDom de M. tuberculosis mediar la sinapsis entre dos extremos de DNA de secuencia no complementaria. Uno de los elementos clave en el reconocimiento de los extremos es una fuerte interacciA?nA� de cada monA?mero PolDom con el residuo de fosfato (P) del extremo 5A? de la rotura, una propiedad compartida por sus ortA?logos humanos PolI� y PolA�. Por otra parte, un subdominio en forma de lazo (loop1) le sirve a cada monA?mero para extender la protuberancia de cada extremo de DNA y afianzar la sinapsis de ambos extremos. Nuestro trabajo mostrA? por primera vez la estructura 3D de un complejo de NHEJ, que es mediado A?nicamente por el enzima de polimerizaciA?n (PolDom en este caso) y que, de acuerdo con los datos bioquA�micos, refleja la etapa de bA?squeda de microhomologA�a entre extremos no complementarios. Hasta ese momento existA�a muy poca informaciA?n de cA?mo las diferentes actividades de procesamiento de extremos que operan durante el NHEJ, ya fuesen proteA�nas independientes (mamA�feros) o dominios estructurales de una A?nica proteA�na (bacterias), actuaban de forma secuencial y coordinada. La sinapsis de extremos observada en la estructura 3D descrita en este trabajo incluye pares de bases complementarios, pares incorrectos, bases dislocadas, y la formaciA?n de un hairpin a partir de los extremos 3A?, y por lo tanto refleja la etapa de alineamiento de extremos previa a su procesamiento por las actividades nucleasa, polimerasa, y ligasa, todas ellas presentes en el caso de las LigD bacterianas.

En el A?ltimo trabajo resultado de esta fructA�fera colaboraciA?n, hemos demostrado la existencia, por primera vez, de un complejo pre-ternario en el que el enzima estA? unido a un extremo de la rotura, y que estA? preconfigurado para la catA?lisis, a la espera de la aproximaciA?n del segundo extremo que aportarA? el necesario a�?primera�? para que tenga lugar la catA?lisis y conexiA?n vA�a NHEJ. Este intermedio, cuya existencia demostramos tambiA�n en soluciA?n, es crA�tico para que estos enzimas sean capaces de reunir roturas cuyos extremos tienen una complementariedad muy exigua o inexistente.

Estos estudios han sido co-dirigidos por el Dr. Aidan Doherty (Sussex Centre for Genome Damage and Stability. UK), responsable de los estudios estructurales, y por el Dr. Luis Blanco (Centro de BiologA�a Molecular Severo Ochoa. CSIC. Madrid), responsable de los estudios funcionales.

Aplicabilidad biotecnolA?gica

La empresa biotecnolA?gica X-Pol Biotech S.L., que forma parte del grupo Genetrix, posee la licencia de explotaciA?n del sistema de NHEJ bacteriano, concedida recientemente por la Universidad de Cambridge, UK. Una de los primeros desarrollos que se estA?n llevando a cabo, aprovecha a simplicidad de este sistema de reparaciA?n de roturas, basado A?nicamente en dos componentes protA�icos, ya que resulta idA?neo para su utilizaciA?n en procesos biotecnolA?gicos que requieran procesamiento de fragmentos de DNA, ya sea para la reparaciA?n de roturas o daA�os, como para la generaciA?n de librerA�as de DNA.

En cuanto a su relevancia clA�nica, nos debemos preguntar: A?cual es pues el papel in vivo de este sistema de NHEJ bacteriano?A� Los datos sugieren que el sistema se encarga de las DSBs producidas durante la fase estacionaria (no replicativa) o durante la fase de espora. Mediante estudios de eliminaciA?n de la funciA?n LigD, se ha demostrado que el proceso de NHEJ es una fuente de variabilidad genA�tica en bacterias, necesaria para que estos organismos puedan sobrevivir adaptA?ndose a situaciones de estrA�s genotA?xico.

En X-Pol nos hemos planteado evaluar el dominio de polimerizaciA?n de las LigD bacterianas como una posible diana de interferencia del proceso de reparaciA?n de roturas de cadena doble en estos organismos. Si bien la relevancia de incorporar ribonucleA?tidos, como a�?unidades incorrectasa�? de A?cido nucleico, durante la reparaciA?n de DSBs en el DNA bacteriano se desconoce por el momento, la eliminaciA?n selectiva de este proceso podrA�a tener importancia clA�nica como fA?rmula para minimizar el impacto de la adquisiciA?n de determinadas resistencias bacterianas.

BibliografA�a especA�fica

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Pitcher RS, Brissettt NC, Picher AJ, Andrade P, JuA?rez R, Thompson D, Fox GC, Blanco L and Doherty AJ. (2007) Structure and function of a mycobacterial NHEJ DNA repair polymerase. J. Mol. Biol. 366, 391-405.

Brissett NC, Pitcher RS, Juarez R,A� Picher AJ, Green AJ, Dafforn TR, Fox GC, Blanco L* and Doherty AJ* (2007) Structure of a NHEJ polymerase-mediated DNA synaptic complex. Science 318, 456-459 (*corresponding author).

Brissett NC, Martin MJ, Pitcher RS, Bianchi J, Juarez R, Green AJ, Fox GC, Blanco L* and Doherty AJ* (2010) Structure of a novel pre-ternary complex involving a prokaryotic NHEJ polymerase. Molecular Cell (2^nd rev/ in press). (* corresponding author)