Sylentis, empresa biofarmacA�utica del grupo zeltia, investigan el silenciamiento gA�nico del ARN de interferencia

Sylentis desea posicionarse como empresa de referencia dentro del sector de nuevas terapias basadas en la tecnologA�a del RNAi y, en especial, dentro de las enfermedades oculares, inflamatorias y neurodegenerativas. Para ello cuentan con la garantA�a de un equipo humano de primera lA�nea con gran experiencia en el campo del RNAi que permanecen continuamente actualizados en todo aquel progreso tA�cnico o cientA�fico que se produce en este campo, siempre a la vanguardia de la innovaciA?n tecnolA?gica.

La actividad de Sylentis se basa principalmente en la bA?squeda de molA�culas terapA�uticas basadas en la tecnologA�a del RNAi que puedan actuar frente a diversas patologA�as. Entre las diversas patologA�as que se estA?n estudiando se encuentran glaucoma, dolor ocular asociado al sA�ndrome del ojo seco, enfermedad de Crohn, enfermedades relacionadas con el sistema nervioso central (daA�o en la espina dorsal) y enfermedades neurodegenerativas (enfermedad de Alzheimer), asA� como vA�as de administraciA?n alternativas de estos compuestos. Nuestro objetivo a corto plazo son las enfermedades oculares y dentro de ellas el glaucoma y el dolor ocular asociado al sA�ndrome del ojo seco, las cuales ya se encuentran en desarrollo clA�nico. A medio y a largo plazo queremos ampliar nuestra A?rea de desarrollo a diferentes enfermedades tanto enfermedades de gran impacto socio-econA?mico como enfermedades raras como nichos de mercado. Para ello, con el fin de identificar nuevas dianas de interA�s, mantenemos contratos externos de investigaciA?n en A?reas complementarias a las nuestras, que nos permiten estar al dA�a de los avances mA?s importantes que se realizan en diferentes A?reas terapA�uticas.

LA�neas de investigaciA?n

Actualmente las principales lA�neas de investigaciA?n de Sylentis son las siguientes:

• LA�nea ocular: Dentro de esta lA�nea estamos desarrollando tratamientos principalmente para el glaucoma y para el sA�ndrome de ojo seco, dos afecciones muy comunes en la sociedad actual y cuya incidencia se espera que incremente en los prA?ximos aA�os debido al envejecimiento de la poblaciA?n y al modo de vida actual.

• Glaucoma: mediante RNAi inhibimos diferentes dianas implicadas en el proceso patolA?gico del glaucoma. Actualmente tenemos un producto, el SYL040012 (Bamosiran) con el cual se ha realizado todo el desarrollo preclA�nico toxicolA?gico un ensayo en Fase Ia, un ensayo en Fase Ib y un ensayo clA�nico Fase IIa. Durante el 2014, se iniciarA? un ensayo clA�nico Fase IIb continuando con el desarrollo clA�nico del SYL040012.

• Dolor ocular/SA�ndrome del ojo seco: el objetivo en este proyecto es inhibir los receptores TRPV1, implicados en la sensaciA?n de dolor e irritaciA?n ocular mediante la tecnologA�a del RNAi. Disponemos de un producto, el SYL1001, con eficacia demostrada en modelos animales, y con el que se ha realizado todo el desarrollo preclA�nico toxicolA?gico, y un ensayo clA�nico en Fase I. Actualmente, se estA? llevando a cabo un ensayo de prueba de concepto piloto en humanos con el SYL1001.

• LA�nea inflamatoria: Sylentis se ha centrado en la enfermedad inflamatoria intestinal como principal afecciA?n dentro de esta lA�nea de investigaciA?n. En concreto, en la enfermedad de Crohn, un trastorno crA?nico que se caracteriza por una inflamaciA?n del tracto gastrointestinal que puede ocurrir en todo su recorrido, de la boca hasta el ano, pero que es mA?s frecuente en la porciA?n inferior del intestino delgado. Sylentis trabaja para bloquear la respuesta inflamatoria asociada a esta enfermedad mediante la aplicaciA?n de la tecnologA�a de RNAi. En esta lA�nea de investigaciA?n se han realizado las pruebas de concepto en animales con resultados muy positivos. Actualmente estamos trabajando en la mejora del sistema de administraciA?n del ARN de interferencia.

• LA�nea sistema nervioso central: Sylentis ha desarrollado un mA�todo de administraciA?n de siRNAs al sistema nervioso central basado en la administraciA?n intranasal. Este sistema resulta especialmente ventajoso ya que permite evitar la administraciA?n sistA�mica, especialmente complicada debido a la rapidez con la que se degrada el siRNA en sangre (cuestiA?n de minutos), y permite evitar el problema de dirigir los compuestos hacia el sistema nervioso central para lo que deberA�an atravesar la barrera hematoencefA?lica.

• LA�nea de investigaciA?n bA?sica: Dada la rapidez con la que se degrada el RNAi en contacto con las enzimas RNasas presentes tanto en el ambiente como en los fluidos biolA?gicos, una de las lA�neas de investigaciA?n de Sylentis consiste en desarrollar formulaciones y modificaciones quA�micas de la estructura de los compuestos que median el RNAi con el fin de incrementar la estabilidad y eficacia in vivo de nuestros productos.

En la siguiente figura se resume el estado de cada uno de los proyectos:

Pipeline de Sylentis

Estrategia

Sylentis nace con la idea de explotar la nueva tecnologA�a del RNAi y liderar la puesta en el mercado de fA?rmacos basados en RNAi. Sylentis es la primera empresa espaA�ola dedicada a la aplicaciA?n terapA�utica de la tecnologA�a del RNAi y estA? a la cabeza de lasA� empresas europeas en ensayar un producto basado en el RNAi en humanos. A nivel mundial,A� varias empresas estA?n desarrollando productos. La tecnologA�a del RNAi estA? siendo de gran interA�s para las empresas farmacA�uticas ya que presentan varias ventajas del desarrollo farmacA�utico frente a los fA?rmacos a�?tradicionalesa�?:

a) La posibilidad de tomar como diana prA?cticamente cualquier proteA�na. Los medicamentos tradicionales sA?lo pueden dirigirse contra ciertos tipos de proteA�nas. Los intentos de dirigir molA�culas pequeA�as o anticuerpos monoclonales -tipos de medicamentos tradicionales- contra algunas clases de proteA�nas han sido infructuosos en su mayorA�a. Por el contrario, gracias a la secuenciaciA?n del genoma humano es posible diseA�ar pequeA�os ARN de interferencia (small interfering RNAs, siRNAs) dirigidos a cualquier diana que pueda estar implicada en una patologA�a. Para ello basta con conocer la secuencia del ARN mensajero (mRNA) asociado a la proteA�na alterada.

b) Las terapias basadas en RNAi bloquean la producciA?n de proteA�nas, mientras que los medicamentos tradicionales se dirigen a las proteA�nas ya producidas. Los siRNAs atacan la raA�z del proceso, por lo que tienen la oportunidad de aportar mayor eficacia al control de la enfermedad.

c) El desarrollo de un siRNA desde el inicio del proceso hasta llegar a ensayos clA�nicos es mucho mA?s breve que el que se necesita con los fA?rmacos tradicionales: en el caso del siRNA, se estima entre 15 y 24 meses; en molA�culas pequeA�as, de 42 a 66 meses, y en anticuerpos monoclonales, de 27 a 50 meses. Esto es debido principalmente a que los siRNAs se diseA�an racionalmente: la identificaciA?n de posibles medicamentos se realiza seleccionando mediante herramientas bioinformA?ticas las secuencias complementarias al mRNA diana mA?s adecuadas.

d) Mayor duraciA?n de los efectos del medicamento: los siRNAs permanecen en la cA�lula impidiendo la fabricaciA?n de proteA�nas, por lo que los efectos de cada administraciA?n se pueden prolongar durante varios dA�as. Este hecho constituye una gran ventaja frente a los medicamentos existentes, ya que al disminuir las administraciones mejora la calidad de vida del paciente.

Sylentis aplica la tecnologA�a de RNAi con el fin de encontrar molA�culas con potencial terapA�utico para diferentes enfermedades. La tecnologA�a SIRFINDER^A� desarrollada por Sylentis permite la obtenciA?n de siRNAs con potencial farmacolA?gico a travA�s de una bA?squeda de las secuencias mA?s adecuadas mediante herramientas bioinformA?ticas. De este modo Sylentis, una vez identificado el gen diana involucrado en una enfermedad, es capaz de desarrollar siRNAs dirigidos a dicho gen en un plazo breve de tiempo y con un coste reducido. Puede afirmarse que en esto estriba la principal ventaja competitiva de Sylentis, en el diseA�o eficiente de siRNAs. Sylentis tambiA�n tiene una sA?lida experiencia en la validaciA?n in vitro de siRNAs, tarea que se realiza internamente. Los siguientes pasos del proceso a��validaciA?n in vivo y modos de administraciA?n del siRNA- ya son externalizados. Sylentis cuenta con una red de colaboradores que aportan la experiencia y los modelos animales necesarios para contrastar la eficacia del siRNA y desarrollar un modo de administraciA?n eficaz.

Propiedad industrial

Siendo consciente de la importancia de los derechos de Propiedad Industrial en las industrias farmacA�utica y biotecnolA?gica, Sylentis ha establecido una estrategia de protecciA?n en todo el mundo. El portafolio de Propiedad Industrial de Sylentis proviene de tecnologA�a desarrollada internamente, que se complementa con los acuerdos de licencia que son necesarios en cada caso. A finales de 2013, el portafolio de patentes de Sylentis estA? constituido por 96 expedientes activos que se encuentran todavA�a en tramitaciA?n, englobados en 7 familias de patentes, cada una de las cuales protege una invenciA?n independiente. Estas patentes estA?n relacionadas con las diferentes A?reas de actividad que desarrolla la compaA�A�a, tales como la oftalmologA�a, la inflamaciA?n y el tratamiento de afecciones del sistema nervioso central.

C.RNA de transferencia

El ADN (A?cido desoxirribonucleico) es el principal componente de los cromosomas y constituye el material genA�tico del ser humano. La expresiA?n gA�nica es el proceso mediante el cual la informaciA?n codificada en el ADN se transforma en las proteA�nas necesarias para el desarrollo y funcionamiento del organismo. El primer paso de este proceso se denomina transcripciA?n del ADN y da lugar, mediante un enzima llamado ARN polimerasa, a una molA�cula conocida como mRNA. El mRNA sale del nA?cleo celular y es procesado en el ribosoma, que a partir de esa informaciA?n produce la proteA�na correspondiente a travA�s del proceso que se conoce como traducciA?n.

El RNAi es un mecanismo, existente en la biologA�a celular de forma natural, de silenciamiento post-transcripcional de genes especA�ficos, ejercido por molA�culas de ARN que, siendo complementarias a un mRNA, conducen a la degradaciA?n de A�ste, impidiendo asA� su traducciA?n en proteA�nas. Este mecanismo permite disminuir la producciA?n de proteA�nas, inhibiendo la sA�ntesis de proteA�na de una manera selectiva. Este tipo de fA?rmacos actA?an en un momento del proceso anterior a los medicamentos actuales: no bloquea las proteA�nas ya creadas, sino que impide la propia creaciA?n de las proteA�nas.

En el 2006 se concediA? el premio Nobel de FisiologA�a y Medicina a los doctores Andrew Fire, del Instituto TecnolA?gico de Massachussets, y Craig Mello, de la Universidad de Harvard, por su trabajo en RNAi, lo que demuestra la trascendencia de este descubrimiento. El descubrimiento del RNAi constituye una autA�ntica revoluciA?n en BiologA�a, y permite abordar el diseA�o y desarrollo de medicamentos desde una perspectiva completamente nueva.

a)La expresiA?n gA�nica - B)El silenciamiento gA�nico

El silenciamiento gA�nico por RNAi puede lograrse mediante las molA�culas denominadas ARN interferente pequeA�o o ARN pequeA�o de interferencia (o a�?siRNAa�?). Los siRNAs son una clase de ARN bicatenario con una longitud de 19 a 27 nucleA?tidos. Cada siRNA es altamente especA�fico para la secuencia de nucleA?tidos de su ARN mensajero diana, al que degrada, inhibiendo la sA�ntesis de la proteA�na que codifica. Los siRNAs se encuentran de forma natural en la cA�lula y cumplen diversas funciones ademA?s de su papel en la ribointerferencia; como mecanismo antiviral, por ejemplo. Se producen mediante el procesamiento del RNA por la enzima Dicer (una endonucleasa).

Los siRNAs tambiA�n pueden ser introducidos artificialmente en las cA�lulas con el fin de silenciar un gen especA�fico. Cualquier gen del que se sepa la secuencia puede ser la diana de un siRNA fabricado a medida con la secuencia complementaria a la de dicho gen. Por tanto, los siRNA son una herramienta inestimable en el estudio de las funciones de los genes, en la validaciA?n de las dianas terapA�uticas, en el estudio del mecanismo de acciA?n de medicamentos o como terapia para enfermedades de origen genA�tico.

Estructura de un sirna

Estructura de un siRNA

El desarrollo de un fA?rmaco basado en el RNAi tiene numerosas ventajas respecto a los fA?rmacos tradicionales: la posibilidad de tomar cualquier proteA�na como diana terapA�utica, incremento de especificidad, mayor duraciA?n del efecto, y menos efectos secundarios al ser degradados por RNAsas presentes en plasma y tejidos.

Pruebas preclA�nicas y clA�nicas

Los productos en las Fases clA�nicas mA?s avanzadas que estA? desarrollando Sylentis son el SYL040012 y el SYL1001, los cuales son productos basados en la tecnologA�a del RNAi para el tratamiento del glaucoma y el dolor ocular asociado al sA�ndrome del ojo seco respectivamente.

El glaucoma es un grupo de enfermedades oculares caracterizada por un daA�o en el nervio A?ptico que provoca una pA�rdida progresiva de visiA?n y que puede acabar en ceguera. En la actualidad es una de las mayores causas de ceguera en el mundo. Esta enfermedad transcurre de manera asintomA?tica hasta que se empieza a detectar una pA�rdida del campo de visiA?n. El glaucoma suele ir asociado a una alta presiA?n intraocular (PIO). Cuando el humor acuoso no es drenado correctamente, se acumula en la cA?mara anterior del ojo, produciendo un aumento de la PIO. Esta hipertensiA?n ocular produce daA�os en el nervio A?ptico, comprometiendo asA� la visiA?n de forma grave e irreversible.

Actualmente no existe una cura para el glaucoma, sino solamente tratamientos que logran detener su avance. La mayorA�a de las terapias se dirigen a disminuir la PIO, bien disminuyendo la sA�ntesis de humor acuoso, bien facilitando su drenaje a travA�s de la malla trabecular, impidiendo por tanto su acumulaciA?n en la cA?mara ocular. TambiA�n se estA?n ensayando terapias neuroprotectoras, orientadas a proteger el nervio A?ptico. Tradicionalmente, los fA?rmacos mA?s prescritos para el tratamiento del glaucoma eran los betabloqueantes. Sin embargo, la apariciA?n de los anA?logos de las prostaglandinas hace aproximadamente 15 aA�os desplazA? a los betabloqueantes como fA?rmacos estrella en el tratamiento del glaucoma.

A pesar de los tratamientos disponibles, hay un alto A�ndice de incumplimiento de la administraciA?n del fA?rmaco por parte del enfermo diagnosticado con glaucoma. Aproximadamente la mitad de los enfermos abandona la terapia despuA�s de 6 meses. Una de las posibles causas de esta falta de cumplimiento se basa en el hecho de que muchos de los tratamientos tienen que administrarse dos o tres veces diarias. En este sentido son de gran utilidad formulaciones que se administran una sola vez al dA�a.

El SYL040012 estA? indicado para el tratamiento de la hipertensiA?n ocular asociada a Glaucoma. La forma farmacA�utica del SYL040012 es un colirio de soluciA?n oftA?lmica para aplicaciA?n tA?pica. El SYL040012 actA?a como un inhibidor selectivo de la sA�ntesis de receptores I?2-adrenA�rgicos. Los receptores beta-adrenA�rgicos estA?n involucrados en el sistema vascular, dilataciA?n bronquial, relajaciA?n de la movilidad intestinal, lipA?lisis, incremento de glicA?lisis y gluconeogA�nesis en el hA�gado y control de la presiA?n a nivel ocular. Los inhibidores beta-adrenA�rgicos son usados comA?nmente como drogas antiglaucomatosas. Este tipo de compuestos reducen la PIO probablemente reduciendo la producciA?n de lA�quido (humor acuoso) en el ojo. De esta manera reducen el riesgo de daA�o al nervio A?ptico asociado a la pA�rdida de visiA?n.

En estudios in vitro e in vivo se ha demostrado que el SYL040012 reduce especA�ficamente los niveles de ARNm que codifica para los receptores beta2-adrenA�rgicos, no afectando los niveles de los receptores relacionados alfa- y beta1-adrenA�rgicos. De esta manera se garantiza que el efecto ejercido por este fA?rmaco es altamente especA�fico, lo cual era esperado por ser un fA?rmaco diseA�ado secuencia especA�fico. En estudios in vivo se ha demostrado que tras la instilaciA?n del fA?rmaco en conejos con una elevada PI) se disminuyen los niveles de presiA?n de una manera sostenida en el tiempo. Tras la A?ltima aplicaciA?n del fA?rmaco los niveles de PIO pueden permanecer disminuidos hasta 72 horas, siendo este efecto muy superior al conseguido por los fA?rmacos actuales en el mercado que no superan las 8 horas. Del mismo modo, la aplicaciA?n del fA?rmaco previa a una inducciA?n de la PIO por sobrecarga de agua previene la elevaciA?n de los niveles de PIO de una manera significativa previniendo hasta un 70% el incremento de PIO observado en animales tratados con vehA�culo (placebo).

La mayor duraciA?n del efecto del fA?rmaco se debe a que A�ste actA?a a nivel de los ARNm en el citoplasma previniendo la sA�ntesis de los receptores: cuando el fA?rmaco es eliminado, la cA�lula debe de dar la orden y sintetizar nuevos receptores, lo que conlleva un mayor tiempo dependiendo del ciclo de vida del receptor.

Esta mayor duraciA?n del efecto garantiza que el paciente estA? protegido de los posibles efectos de una PIO elevada durante un mayor tiempo. Garantizando asA� que el paciente estA? tratado entre aplicaciones evitando asA� repuntes de la PIO muy perjudiciales para el nervio A?ptico. Estos repuntes de presiA?n suelen observarse comA?nmente como efecto secundario de los fA?rmacos actuales.

El SYL040012 es un siRNA altamente sensible a las RNAsas, enzimas muy comunes en fluidos biolA?gicos. Se han realizado varios estudios de biodistribuciA?n del SYL040012, a un grupo de conejos blancos de Nueva Zelanda se les administrA? una A?nica dosis de SYL040012 en gotas tA?picas; a los 5 y 30 minutos despuA�s de la administraciA?n se extrajeron los ojos y fueron procesados para el anA?lisis de SYL040012 y 5a��P-SYL040012. La fosforilaciA?n 5a�� de los siRNAs tiene lugar en el citoplasma de la cA�lula una vez el siRNA ha escapado del trA?fico endosomal. La detecciA?n de 5a��P-SYL040012 sirve como marcador para el transporte al interior de la cA�lula del compuesto (ver los resultados en la Figura 4 y la Tabla 1). Este estudio mostrA? que la vida media del SYL040012 en plasma es menor de 5 minutos. Esta baja disponibilidad plasmA?tica garantiza la ausencia de efectos secundarios asociados a la circulaciA?n sistA�mica. Este estudio tambiA�n demostrA? que despuA�s de la administraciA?n ocular tA?pica del SYL040012, el mayor contenido de SYL040012 activo (5a��P-SYL040012) se encuentra en el cuerpo ciliar; SYL040012 activo tambiA�n fue detectado en las cA�lulas de la cA?rnea y el iris .AdemA?s, ningA?n compuesto activo se detectA? en los tejidos sistA�micos o en plasma.

El futuro de Sylentis

Sylentis tiene previsto iniciar un estudio en Fase IIb del SYL040012 para el tratamiento del glaucoma en diferentes paA�ses de la UE y EEUU, dicho ensayo comenzarA? durante el aA�o 2014.

Para el producto SYL1001 para el tratamiento del dolor ocular, a lo largo de este aA�o tienen previsto completar el ensayo actual y comenzar un estudio de Fase II a nivel europeo.

Actualmente la compaA�A�a ha realizado un total de cinco ensayos clA�nicos con productos basados en la tecnologA�a del RNAi, demostrando que estos compuestos son una alternativa terapA�utica eficaz a medio plazo para pacientes con patologA�as oculares. De este modo Sylentis sigue apostando por el desarrollo de productos novedosos para el tratamiento de enfermedades oculares.